用R实现批量差异分析(t检验和方差分析),自己算P值-Bluesky's blog

对于二代数据的表达差异分析，理论上应该用reads counts进行计算。这个在我们论坛的专题帖已经有解释：

第14期“基因表达量计算和差异表达分析（下）”【视频】

www.omicshare.com/forum/thread-236-1-12.html

同时，在我们OS-tools已经有基于edgeR软件的差异分析工具。但依然有网友问，如果手头没有reads count数据，而只有RPKM/FPKM值该怎么办？

这个时候，就只能退而求其次，使用t检验或者方差分析。但注意，这两种检验是基于正态分布的检验方法，是不适用于二代数据的，对低丰度基因的检验会产生大量假阳性。不到万不得已不要使用这类方法。

如果非使用不可，可以：

使用以下的R脚本进行批量差异检验（t检验或方差分析）；
请将在两组样本中表达量RPKM值均低于1的基因过滤掉（t检验和方差分析在低丰度基因中，假阳性过高，P value不可靠）。

请确定你认真看了上面两点使用建议，再开始看代码。

# t检验的代码如下：

a=read.table(“all_fpkm.txt”,header=T,sep=”\t”)

#预生成2个长度与输入文件行数相同的全为0的向量，将用于存储p value和差异倍数（log2FC）

Pvalue<-c(rep(0,nrow(a)))

log2_FC<-c(rep(0,nrow(a)))

# 2~4列是处理组1,5~7列是处理组2；

#将使用循环对每一行进行t检验

#如果某一行两组的标准差都等于0，将无法进行t检验，所以这些行使用NA替代

#每一行计算得到p value和log2FC将被加入原文件的后两列；

#计算log2FC时，每组均值加0.001，是为了防止分母为0导致bug；

for(i in 1:nrow(a)){

if(sd(a[i,2:4])==0&&a[i,5:7]==0){

Pvalue <- “NA”

log2_FC<- “NA”

}else{

y=t.test(as.numeric(a[i,2:4]),as.numeric(a[i,5:7]))

Pvalue<-y$p.value

log2_FC<-log2((mean(as.numeric(a[i,2:4]))+0.001)/(mean(as.numeric(a[i,5:7]))+0.001))

}

}

# 对p value进行FDR校正

fdr=p.adjust(Pvalue, “BH”)

# 在原文件后面加入log2FC，p value和FDR,共3列；

out<-cbind(a,log2_FC,Pvalue,fdr)

write.table(out,file=”ttest.out.xls”,quote=FALSE,sep=”\t”,row.names=FALSE)

##########################我的理解##################################
我感觉代码有问题，经过我改完以后代码如下（我的数据是2个重复，我的测试数据： test_of_yangl.txt ）：
最后我觉得这么算的P值不靠谱，不推荐使用自己算P的值

##setwd(“F:/”)
a=read.table("RA24C.txt",header=T,sep="\t") 
a
#预生成2个长度与输入文件行数相同的全为0的向量，将用于存储p value和差异倍数（log2FC）
Pvalue<-c(rep(0,nrow(a))) 
log2_FC<-c(rep(0,nrow(a))) 
# 2~4列是处理组1,5~7列是处理组2；
#将使用循环对每一行进行t检验
#如果某一行两组的标准差都等于0，将无法进行t检验，所以这些行使用NA替代
#每一行计算得到p value和log2FC将被加入原文件的后两列；
#计算log2FC时，每组均值加0.001，是为了防止分母为0导致bug；
for(i in 1:nrow(a)){
 if(sd(a[i,2:3])==0&&sd(a[i,4:5])==0){
 Pvalue[i] <-"NA"
 log2_FC[i]<-"NA"
 }else{
 y=t.test(as.numeric(a[i,2:3]),as.numeric(a[i,4:5]))
 Pvalue[i]<-y$p.value
 log2_FC[i]<-log2((mean(as.numeric(a[i,2:3]))+0.001)/(mean(as.numeric(a[i,4:5]))+0.001)) 
 }
}
# 对p value进行FDR校正
fdr[i]=p.adjust(Pvalue[i], "BH") 
# 在原文件后面加入log2FC，p value和FDR,共3列；
out<-cbind(a,log2_FC,Pvalue,fdr) 
write.table(out,file="RA24C.out.xls",quote=FALSE,sep="\t",row.names=FALSE)

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#方差分析的代码如下，与t检验相比，逻辑相同，只是有些细微的修改。

a=read.table(“all_fpkm.txt”,header=T,sep=”\t”)

#预生成2个长度与输入文件行数相同的全为0的向量，将用于存储p value和差异倍数（log2FC）

Pvalue<-c(rep(0,nrow(a)))

log2_FC<-c(rep(0,nrow(a)))

#确定分组信息

type<-factor(c(rep(“c”,3),rep(“m”,3)))

# 2~4列是处理组1,5~7列是处理组2；

#将使用循环对每一行进行方差检验

#两组表达量都是0的基因，不检验；

#每一行计算得到p value和log2FC将被加入原文件的后两列；

#计算log2FC时，每组均值加0.001，是为了防止分母为0导致bug；

for(i in 1:nrow(a)){

if(sum(a[i,2:4])==0&&sum(a[i,5:7])==0){

Pvalue[i] <- “NA”

log2_FC[i]<- “NA”

}else{

y=aov(as.numeric(a[i,2:7])~type)

Pvalue[i]<-summary(y)[[1]][,5][1]

log2_FC[i]<-log2((mean(as.numeric(a[i,2:4]))+0.001)/(mean(as.numeric(a[i,5:7]))+0.001))

}

}

# 对p value进行FDR校正

fdr=p.adjust(Pvalue, “BH”)

# 在原文件后面加入log2FC，p value和FDR,共3列；

out<-cbind(a,log2_FC,Pvalue,fdr)

write.table(out,file=”anova.out.xls”,quote=FALSE,sep=”\t”,row.names=FALSE)